响应面法优化粪肠球菌摇瓶发酵培养基

人生范文网发表于:2017-09-25 16:17:45

响应面法优化粪肠球菌摇瓶发酵培养基

1,2111莫海燕,包慧芳,王宁,齐洪亮,王

3炜

(1(新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐83005;22(石河子大学生命科学学院,新疆石河子83200;33(,83005)2中国科学院新疆分院乌鲁木齐

:【】,、。【摘要目的对粪肠球菌摇瓶发酵培养基进行优化为高效优质的微生态制剂产品研制奠定基础方

】plackett,burman法首先通过二水平设计的试验分析发酵培养基中对粪肠球菌发酵影响最重要的主要因

;,。素再运用最陡爬坡法对主要因素进行试验获得主要因素的最适范围最后通过响应面分析得到主要因素

的最优水平。【结果】获得最优的发酵培养基配方为:蔗糖22(5%,酵母粉12%,蛋白胨10(5%,磷酸二氢钾

0(2%,0(02%,0(004%,1%。【】,硫酸锰碳酸钙硫酸镁结论在最优发酵培养基培养下粪肠球菌的活菌数从895(8×10cfu/ml6(7×10cfu/ml。初始的提高到

:;;plackett,burman;关键词粪肠球菌发酵培养基响应面试验

+文献标识码:a文章编号:1001,4330(2014)08,1532,09中图分类号:q815;s188.4

optimizationoffermentationmediumforenterocous

faecalisby,esponsseurfacemethod

1,21113mohai,yan,baohui,fang,wangning,qihong,liang,wangwei

(1(,esearchnstituteofappiledmicroboilogy,xinjiangacademyofagriculturalienscecs,urumq,ii

830091,china;2(collegeoflifesciences,shiheziunviersity,shhiezixinjiang83005,2china;3(xinjiang

branch,chineseacademyscofiences,urumqi830011,china)

abstrac:t【objective】inorderobtotaintheefficien,htigh,quailtyproboiticproduct,sthisprojectstudied

theopitmizationofshakingfermeniontatmediumandculturecondtionsiforastrainofenterocousfae-calis(【metho】dfirst,thetwo,leveldesignplackettburmantestwasiedapptolanalyzethemainfactorsof

fermentationmediumandthenthemainfactorsweretestedthroughthesteepestascentmeopthodit-mtoalgetthe

range(finally,throughthe,esponssurefacemethodolog,tyheopitmallevelsofmainfactorswereob-tained(【,esult】theopitmalformulaitonoffermentaiontmediumwa:ssucrose2(25%,yeastextract12,%peptone10(5%,potassiumdihydrogenphosphat(e2%0,magneisumsulfate0(02%,manganesesulfate(0004%,andcalciumcarbona(t0e%1(【conclusion】enterocousfaecaliswereculturedbytheopitmizedfer-

99mentaitonmedium,andtheviablecountreached(7×610cfu/mlfromtheoriginal5(8×10cfu/ml(

keywords:enterocousfaecalis;fermentaiontmediumopitmization;placket,tburma;n,esponssure-

facemethodoogyl

0引言

【研究意义】粪肠球菌(enterocousfaecalis)是乳酸菌中的一类,属于链球菌科(streptoaocecae)肠

收稿日期:2013,12,19:(201111112);(20116005);基金项目新疆维吾尔自治区高技术项目新疆维吾尔自治区国际合作项目乌鲁木齐市科技计划

(k111410004):(1987,),,,,,(e,mail)[email protected](作者简介莫海燕女新疆人硕士研究生研究方向为生物化学与分子生物学

:(1965,),,,,,(e,mail)[email protected](通讯作者王炜男湖北人研究员研究方向为微生物工程

1533:8期莫海燕等响应面法优化粪肠球菌摇瓶发酵培养基

,1,(enterocous)。,,,,。球菌属细胞球形链状排列无芽孢兼性厌氧革兰阳性球菌是人类和动物肠道

,,。正常菌群的一部分可直接参与宿主的物质代谢活动是宿主正常生理活动重要因素粪肠球菌能发酵,2,。1045?6(5%,,,,多种糖产酸不产气属于同型发酵粪肠球菌能在和生长化学耐性高可生长于,。、nacl9(6ph和的环境等广泛分布于自然界中利用从健康人或动物分离的具有生理功能无毒害的粪

(animalmicroecooglcaiiagen,tamea),肠球菌及其他益生菌可以制成动物微生态制剂可替代抗生素防,3,4,。,微生态制剂中起主要作用的是活性微生物保证制剂中、治动物的一些消化道疾病调整生态平衡

,活性微生物的含量能提高菌种在肠道中的定植率因此提高产品中活性微生物的含量对发挥其益生作,5,。【】,前人研究进展粪肠球菌能抑制肠道内一些产尿素酶的细菌和腐败菌的生长繁殖进用至关重要,6,,7,。,。同时还可产生天然有机酸有利于机体健康粪肠球菌在生长而降低血液中内毒素和氨的浓度

,,繁殖过程中不仅能产生乳酸这类的有机酸而且还能产生多种具有抑菌杀菌作用的细菌素细菌素不仅,8,hosniaabdel,mohsein等从食品中分离。能抑制动物源病原微生物的繁殖还能抑制食物腐败菌的生长,。enterocinp出得到能产生细菌素的肠球菌随后对其生物学特性进行了深入的研究有报道称从牛粪,9,。从牛的胃肠道分离出一株希氏肠堆肥中分离的肠球菌具有能抑制食物源病原微生物活性的作用,10,。、、、有研究报道了从扁角鹿鸵鸟肠道小型猪粪便鸵鸟胃,球菌此菌株能明显抑制李斯特菌属的活性

食物源肠球、、、分离得到的动物源肠球菌和从青贮饲料西班牙橄榄乳酪发酵剂意大利腊肠等分离得到的,11,,12,。16srdnagenbank,菌都能产生细菌素许多学者将肠球菌序列上传到黎满香等根据对比粪肠

,16srdna,,pc,球菌与其他肠球菌种间序列的差异设计引物建立了粪肠球菌检测方法以应用于实,13,,从酸奶中分离得到疑似乳酸粪肠球菌的微生态菌株对其进。验室日常对一些粪肠球菌的鉴定杨霞

,r,na16s系统进化分析鉴定该菌,行了各种理化特性鉴定随后在此基础上从分子水平又对其进行了

placket,t。【】。株为粪肠球菌本研究切入点在以往的研究中对粪肠球菌发酵工艺的研究较少通过,。【】burman试验和响应面试验对粪肠球菌摇瓶发酵培养基进行优化研究拟解决的关键问题发酵培

、。养基的作用不仅供菌体生长繁殖还供菌体合成产物它既要使接种后的种子能迅速繁殖到一定浓,。,度又要使菌体能快速合成产物因此发酵培养基的营养成分应丰富要有菌体生长所需的促生长因子。ph值总体来说发酵培养基不,,和促进产物合成的物质等碳氮比应合理添加缓冲剂维持培养基稳定的、,仅要有利于菌体合成产物合成还应该能持续较长时间的高生产速率同时发酵培养基的原料要因地制,。,宜质优价廉从而降低生产成本实验通过优化粪肠球菌的发酵培养基提高其在发酵培养过程中的活,。菌数从而使其能更好的发挥益生作用

1材料与方法

1(1材料

1(1(1菌种

粪肠球菌(ef,2)由新疆农业科学院微生物应用研究所农业微生物研究室在前期研究工作中分离

。筛选获得

1(1(2主要仪器、试剂

微波炉,msspx,250型生化培养箱,sw,cj,2fd型双人单面净化工作台,mls,3020高压蒸汽灭菌锅,phs,3c酸度计,恒温摇床,岛津电子天平。

、、、、、、、、、。蔗糖葡萄糖玉米淀粉可溶性淀粉蛋白胨酵母粉牛肉膏硫酸铵硫酸镁磷酸氢二钾等1(1(3培养基

(1)斜面保存培养基:葡萄糖2(0%、酵母粉0(5%、牛肉膏1(0%、蛋白胨1(0%、硫酸镁0(058%、硫酸锰0(005%,ph值7(0。

(2):3(5%、1(0%、1(0%、1(0%、0(4%、种子培养基葡萄糖酵母粉牛肉膏蛋白胨乙酸钠磷酸氢

0(1%、0(1%、0(06%、0(006%、801ml、1(0%,ph柠檬酸氢二铵硫酸镁硫酸锰吐温值碳酸钙二钾

1534新疆农业科学51卷

8.0。

(3):1(0%、0(5%、0(5%、0(1%、0(02%、发酵培养基葡萄糖酵母粉蛋白胨磷酸氢二钾硫酸镁硫

0(002%,ph7(0。值酸锰

1(2方法

1(2(1培养方法

1(2(1(1种子液培养

将保存的菌种在培养基上划线接至斜面培养基上活化,30?恒温培养48h。用5ml无菌水将菌落从斜面上洗下,取1ml菌液接入装有40ml液体种子培养基的200ml30?、180r/min三角瓶中,培养18h,获得种子液。

1(2(1(2摇瓶发酵培养

按5%的接种量将种子液接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中,34?、180r/min下培养

。18h,od测定发酵液值600

1(2(2测定

1(2(2(1ph

精密ph试纸。

1(2(2(2活菌量

将ef,2发酵液按10倍梯度进行稀释,取0(1ml稀释后的发酵液涂布于培养基,每一梯度重复3皿,30?培养48h,计数活菌数(cfu/ml)。

1(2(3试验设计

1(2(3(1单因素确定ef,2的最佳碳源

,1(0%、、、ef,2分别用的葡萄糖蔗糖可溶性淀粉甘油和乳糖作为发酵培养基的碳源进行摇瓶发

。ef,2。酵培养考察不同碳源对发酵的影响

,、、、、1(2(3(2ef,2单因素确定的最佳氮源保持总氮量不变分别用酵母粉牛肉膏蛋白胨硫酸铵酵母

、+、+蛋白胨牛肉膏蛋白胨酵母粉

粉+牛肉膏分别作为ef,2的氮源,进行摇瓶发酵培养。考察不同氮源对ef,2发酵的影响。1(2(3(3plaekett,burman设计法筛选显著影响因素

plaekett,burman实验设计法通过分析每个影响因素的两个水平,比较两水平的差异和整体的差异,15,,。ef,2od从而确定每个因素的显著性达到快速准确筛选出主效因素的目的以发酵液的值作为

,6a、b、c、d、e、f响应值发酵培养基的个因素蔗糖酵母粉蛋白胨磷酸氢二钾硫酸镁硫酸锰作为考

,,n=12plackett,burman,3察对象采用实验次数的试验设计表并设置个空白列用以误差分析考察

6od。2,“,1”个因素对发酵液值影响的大小每个因素设定个水平低水平为原始发酵培养基中各上述

。,“+1”2因素的浓度高水平为原始发酵培养基中各因素的浓度的倍数据为三次重复实验数据的平均。ef,2plaekett,burman。1值列出的实验设计及结果表

1(2(3(4最陡爬坡试验

根据plaekett,burman试验得出的一次拟合方程安排最陡爬坡试验。一次拟合方程中各变量的系

,,,,数决定爬坡方向和变化步长如果系数为负则该因素水平应为递减反之递增系数越大则变化步长越

。小

1(2(3(5box,behnken试验设计

发酵培养基中的各个因素并不是孤立发生作用,各因素之间存在交互作用。采用box,behnken试

(3)ef,2。plaekett,验设计水平的实验设计法对发酵培养基影响菌体生长的主要因素进行研究以

,burman)、(x)、(x)box,behnken(x试验筛选得到的蔗糖酵母粉蛋白胨作为试验设计的自变量以123

发酵液的od值为响应值。根据最陡爬坡试验确定的因素最佳水平作为中心点,进行试验,响应面实验

1535:8期莫海燕等响应面法优化粪肠球菌摇瓶发酵培养基

因素编码水平表。表2

表1ef,2plaekett,burman实验设计

table1theresutlsanddesignofplaekett,burmanaboutef,2

编码水平od试验号600abcdefghi

11,1,1,1,10(2241111211111,1,1,1,10(239311,1,1,111,1,10(27641,111,11,1,1,10(2535111,11,1,1,110(2236111,11,111,10(2277111,1,1111,10(3388,111,11,111,10(20491,1,11,1111,1100(208,111,1,111,11110(16211,1,1,1,111,1120(196,1,1,1,1,1,1,1,1,10(221

表2ef,2中心复合实验因素水平

table2testoffactorsandlevelsofdaboutef–2

水平因素代号,101

蔗糖a17(522(520酵母粉910(512b蛋白胨910(512c

1(3数据统计

placket,tburman试验设计及数据分析由minitabv15(0软件完成。中心组合设计及响应面分析由dpsv7(05软件分析处理。

2结果与分析

2(1单因素实验确定发酵培养基碳氮源

2(1(1不同碳源对ef,2发酵的影响

,,不同的菌株对碳源的需求不一样菌体在利用不同碳源时会产生不同的酶并且不同的碳源对发酵

1(0%的葡,。产物的合成产生的作用也不同所以在研究发酵培养基时优化碳源显得尤为重要分别用

,。,ef,2、、、、萄糖蔗糖可溶性淀粉玉米粉乳糖和甘油作为菌株的碳源进行摇瓶发酵培养结果表明以

,。、ef,2葡萄糖蔗糖作为发酵培养基的碳源时菌体的生长情况明显优于其它碳源葡萄糖作为碳源时

,,ef,2odod发酵液的值比蔗糖作为碳源时发酵液的值略高但差距不大考虑到碳源的稳定性和原

ef,2。1,。料成本蔗糖是较好的选择确定发酵培养基的碳源为蔗糖图

,2(1(2ef,2不同氮源对发酵的影响在发酵过程中菌体的生长繁殖和产物合成都需要氮源氮源用于

、合成菌体细胞物质如氨基酸蛋白,16,质、核酸等,同时还用于含氮代谢物的合成。选择酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵、酵母粉+蛋白胨、

,。+、+、+ef,2牛肉膏蛋白胨酵母粉牛肉膏牛肉膏硫酸铵分别作为的氮源进行摇瓶发酵培养结果

,2,+,ef,。2表明对无机氮源硫酸铵的利用较低氮源为酵母粉蛋白胨时菌体生长最佳图

1536新疆农业科学51卷

图1碳源种类下ef,2发酵的变化

fig(1theinfluenceofdifferentcarbonsourceson,2ef

图2氮源下ef,2发酵的变化

fig(2theinfluenceofdifferentnitrogensources,on2fefermentaiont2(2placket,tburmanef,2实验设计确定影响发酵的主要因素

用软件minitab15对实验设计结果进行分析,结果表明,蔗糖、蛋白胨、酵母粉的p值分别为0(031、0(036、0(034,0(05,、、ef,2。3p说明蔗糖蛋白胨酵母粉对发酵的影响显著其它个因素值均均小于

0(05,ef,2。,、、ef,2发酵影响不显著因此确定蔗糖蛋白胨酵母粉为菌种发酵培养基的说明对大于

。3主要因素表

表3ef,2placket,tburman实验各因素

table3thefactorseffectsofplackett,burmanexperimentaboutef,2

tp因素系数标准误差

a蔗糖,0(024000(009538,5(520(031蛋白胨酵0(022330(0095385(140(036b母粉磷酸c0(022830(0095385(250(034氢二钾硫d0(013170(0095383(030(094酸镁硫酸e,0(008670(009538,1(990(184锰,0(008330(009538,1(920(195f

2(3最陡爬坡试验

plackett,burman。ef,2根据试验得出的实验结果设计最陡爬坡试验发酵培养基中各变量的系

,ef,23取试验号时发酵液,。,数该系数决定了爬坡方向和变化步长最陡爬坡试验设计及结果表明

odef,220g/l、。。值最大因此选择此条件作为响应面分析实验的中心点即中心实验点为蔗糖蛋白

1537:8期莫海燕等响应面法优化粪肠球菌摇瓶发酵培养基

胨10(5g/l、酵母粉10(5g/l。表4

表4ef,2最陡爬坡实验设计及其结果

table4thedesignandresultsofsteepestascentabout,2ef

试验号od蔗糖(g/l)蛋白胨(g/l)酵母粉(g/l)600

1157(57(50(254

217(5990(261

32010(510(50(289

422(512120(248

52513(513(50(224

2(4响应面分析

ef,2。ef,2box,behnken根据最陡爬坡试验得出的中心试验点设计响应面试验菌株的试验设

,2box,behnken(),。ef15计三因素三水平及结果显示取三次平行试验的平均值的实验设计共个试

,。5验点零点为区域的中心试验点表

表5ef,2响应面实验设计及结果

table5thedesignandresutlsof,smaboutef,2

变量水平编号od600蔗糖x酵母粉x蛋白胨x1230(2551,1,100(29421,100(2833,1100(35641100(2875,10,10(321610,10(2657,1010(33881010(26690,1,10(2961001,10(275110,110(292120110(271130000(278140000(26215000

运用sas9(2软件对ef,2的响应面试验数据进行二次多项回归分析,获得ef,2发酵液的od值

、,:对蔗糖酵母粉和蛋白胨多元回归方程如下所示

ef,2:y=0(257001+0(011438x+0(022919x,0(016191xx,0(009439xx+回归方程11211120(0115xx22

sas9(2ef,2,,ef,2t用统计软件对的多元回归方程进行分析结果表明由方程各回归系数的值和p值可以进一步了解实验因素的显著性。试验因素中葡萄糖p值远远小于0(01、酵母粉p值=0.002,0(001,、ef,2od。ef,2所以试验因素葡萄糖酵母粉对发酵液值的线性效应比较显著的一次xp0(01,xp0(002,xx(p0(002)、xx(p0(038),项的值远小于的值为值为值为所而且交互项121112

ef,2。ef,2以这几项均对模型具有较高的显著性同时也反应出模型的响应值变化的曲面效应显

2著,不是简单的线性关系。此外,ef,2模型的相关系数为,=97(34%,失拟项的p值为0(551,大于

,0(05,p0(05,ef,2值小于模型分析结果说明回归方程的拟合程度很好模型的预测点和真实模型的

。6值相关度较高表

1538新疆农业科学51卷

表6ef,2模型的系数显著性检验的结果

table6thesignifcanttestresutlsofthemodelcoefifcientsaboutef,2

项系数系数标误t值p值常量0(4692590(004381107(1170(000

,0(0265690(002649,10(0280(000x1x0(0200820(0032106(2550(0022

x0(0020280(0028970(7000(5153

xx0(0282870(0048525(8300(00211

xx0(0002600(0043090(0600(95422

xx0(0060100(0043091(3950(22233xx,0(0101120(003602,2(8080(03812

xx,0(0081110(003664,2(2140(07813

xx,0(0073060(004297,1(7000(15023拟合系数97(41%

2(5绘制响应面立体图及优化结果

,,。ef,2根据拟合的二次回归方程可绘制其响应面立体图进一步分析优化结果

,。,研究表明根据等高线的形状判断因素间交互效应的大小交互作用不显著时等高线呈圆形交互

。,。xxy作用显著则呈椭圆形蔗糖和酵母粉对的交互作用等高线图接近圆形从而反映出这两个因121,y。y素的交互作用不显著但是曲面较陡则表示蔗糖和酵母粉对的影响显著随着蔗糖浓度的增加呈11。,y。,先增加后减小的趋势蔗糖浓度较低时酵母粉对的影响为先增加后减小蔗糖浓度高时酵母粉1。、,yy。3对影响不大蔗糖浓度酵母粉浓度在中心点附近时的试验值最大图11

图3ef,2的响应面和等高线

fig(3,esponisvesurfacesandcontourplotyof=f(x,x)112

。,xxy蔗糖和蛋白胨对的交互作用等高线图接近椭圆形从而反映出这两个因素的交互作用较131

。,。yy显著曲面较陡则表示蔗糖和蛋白胨对的影响显著在蔗糖浓度逐渐增加的情况下表现为先增11。,y。1、,1加后减小的趋势蔗糖浓度高时蛋白胨对影响不大蔗糖浓度在水平附近酵母粉浓度水平1,y。4附近时的试验值最大图1。,xxy酵母粉和蛋白胨对的交互作用等高线图接近椭圆形从而反映出这两个因素的交互作用231。,yy。,、显著曲面较陡酵母粉蛋白胨对的影响显著酵母粉浓度逐渐增大的情况下的值先增加后减11、,,y。1小酵母粉浓度较低时蛋白胨对的影响为先增加后减小酵母粉浓度在水平附近蛋白胨浓度在1

,1,y。5水平附近时的试验值最大图1

3讨论

,,响应曲面法是一种优化生物过程的统计学试验设计方法采用该法可以建立连续变量曲面模型对影响生物过程的因子及其交互作用进行评价,确定最佳水平范围。应用pb设计对培养基的6个因素

1539:8期莫海燕等响应面法优化粪肠球菌摇瓶发酵培养基

进行了筛选,确定了对ef,2发酵影响较大的3个因素:蔗糖、酵母粉、蛋白胨。在此基础上,再用最陡爬坡试验就确定了中心实验点。最后用box,behnken设计进一步优化,得到了蔗糖、酵母粉、蛋白胨3

od=0(257001+0(011438x+0(022919x,0(016191xx,:y因子对发酵液值影响的数学模型11211

20(009439xx+0(0115xx。该模型相关系数,=0(9741,模型与实际情况符合很好,证明该模型能1222

反映出3个因子对发酵液od值的影响。蔗糖和酵母粉的交互作用达到显著水平,说明蔗糖和酵母粉对发酵液od值的影响较为复杂。

图4ef,2的响应面和等高线

fig(4,esponisvesurfacesandcontourplotyof=f(x,x)113

图5ef,2的响应面和等高线

,fig(5,esponisvesurfacesandcontourplotyof=f(x,x)目前通过利用响应面123

,,法优化球粪肠球菌发酵培养基的研究鲜有报道对粪肠球菌的发酵而言传

统的优化方法并不能有效解决发酵过程中各个参数的优化,然而通过响应面法可解决生产中多变量问,,,题还可以对工艺中各个因子水平和交互作用进行有效评价和优化快速确定多因子系统的最佳条件

,。该方法比正交试验更为有效同时也证明了响应面法优化优化粪肠球菌发酵生产工艺条件可行研究,pb、、box,behnken采用的二次响应面回归分析与设计最陡爬坡试验设计相结合的方法与传统方法

,。相比能克服单因素试验等方法带来的一些弊端是十分有效的优化试验方法

4结论

通过单因素试验确定了ef,2发酵培养基的最佳碳、氮源为:蔗糖、酵母粉、蛋白胨。利用响应面法

ef,2。placket,tburman,2ef分对的摇瓶发酵培养基进行了优化首先利用试验设计法确定影响发

、、,,酵的主要因素为蔗糖蛋白胨酵母粉随后用最陡爬坡法确定主要因素的中心点接着采用中心组合实

1540新疆农业科学51卷

验确定ef,2发酵主要因素的最佳水平:蔗糖20g/l、蛋白胨10(5g/l、酵母粉10(5g/l。最后用

,,sas9.2ef,2ef,2软件对的中心组合实验结果进行分析利用因素系数建立二次回归方程最终确定

最佳摇瓶发酵培养基组成:蔗糖22(5%,酵母粉12%,蛋白胨10(5%,磷酸二氢钾0(2%,硫酸镁

0.02%,硫酸锰0(004%,碳酸钙1%。在最优发酵培养基和发酵工艺条件下,ef,2的活菌数从初始的

895(8×10cfu/ml提高到6(7×10cfu/ml。

(,eference)s参考文献

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